脊（jǐ）髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传病，居儿童（tóng）致（zhì）死性常染色体隐性遗传（chuán）病的第2位。位于染色体5q11.2～q13.3上的（de）运动神（shén）经元（yuán）存活基（jī）因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致病基因（yīn）。

　　人基因组有两个紧邻的（de）高度（dù）同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和（hé）着丝粒侧的SMN2，两者（zhě）仅（jǐn）有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因，该基因突（tū）变可导致SMA发病，SMN2为临（lín）床表型的（de）调节基因（yīn），影响病情的严（yán）重程度，其拷（kǎo）贝数增加可减（jiǎn）轻（qīng）SMA表（biǎo）型。目前已知约94％的SMA患（huàn）者为SMN1基因第7和（或（huò））第8外（wài）显子纯合缺失所致，少数病例（lì）可由SMN1基因点（diǎn）突变或小的（de）缺失引起。

　　SMN1基（jī）因外显子缺失检（jiǎn）测的意义

　　SMA在人群中的发病（bìng）率为1/5000～1/10000，群体携带者频（pín）率为（wéi）1/35～1/50，是出生缺（quē）陷的高危因素（sù），因此极（jí）有（yǒu）必要（yào）进行SMA携带者的人（rén）群（qún）筛查，并通过（guò）产前诊断技（jì）术降低人群中SMA患儿的出生率。

　　临床上将（jiāng）SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中（zhōng）间型和（hé）少年型，严（yán）重程度依（yī）次（cì）递减。神（shén）经专科医生一般根据患者发病（bìng）年龄、临床表现及病情进展程度进行临床（chuáng）诊断，辅助检查方法包括肌（jī）电图、肌酶和肌肉（ròu）活检，结（jié）合家族（zú）史和SMN1基因分析可进行（háng）确诊。由于SMA患儿（ér）中约94%为SMN1基因外显子纯合缺失，因此，SMN1基因（yīn）缺失检测（cè）对于SMA的诊断具有更高的灵敏度（dù）和特异性。且对不同型的SMA患（huàn）者，SMN1纯合缺失率（lǜ）没有（yǒu）显著差（chà）异，所以，SMN1纯（chún）合缺（quē）失的检（jiǎn）测对于不（bú）同型SMA患者具有相同的临（lín）床诊断价值。在欧美人群中（zhōng），SMN1基因纯合缺（quē）失（shī）检（jiǎn）测已（yǐ）成为诊断和排除诊断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺失（shī）检测试剂的现状

　　目（mù）前，SMN1基因外显（xiǎn）子缺失检测试（shì）剂较为缺（quē）乏，临床检验实验室较（jiào）为公认的方法是PCR结合限制（zhì）性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法。但（dàn）该方法操作较为繁琐，且（qiě）重复性差，不利于标（biāo）准化（huà），不易推（tuī）广（guǎng）。同时，这种（zhǒng）方法只能（néng）检（jiǎn）测出纯合缺（quē）失，无法确认杂合缺失。

　　荷兰的SMAMLPA检测试剂（jì）可对待（dài）测靶序列进（jìn）行半定量分析，因此既可检（jiǎn）测纯合缺失（shī），亦可确认（rèn）杂合缺（quē）失（shī）。在国内外已有多篇文献报道采用该方法进（jìn）行（háng）SMA患者（zhě）诊断和SMA携带者筛（shāi）查。但该产（chǎn）品目（mù）前仍为“仅用于研究”的试剂，尚未按照（zhào）体外诊断类（lèi）医疗器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国家食（shí）品药品监管（guǎn）总局（jú）批（pī）准了第一项SMN1缺（quē）失突变（biàn）检测试剂（jì）上市。该产品采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单拷贝基因RPP40为内参基因，对SMN1基（jī）因第7外显子和第8外显子拷贝数进行相对定量检测（cè），用于SMA患者的体外辅助分（fèn）子诊断。SMN1基（jī）因外显子（zǐ）缺失检测的难（nán）点之一在于排除高同源性（xìng）基因SMN2的干扰，特（tè）别是（shì）对于SMN2高拷贝数（shù）的受试（shì）者，需保证结果（guǒ）的准（zhǔn）确可靠。该产品通过对实（shí）时荧光（guāng）PCR相对定量、绝对定量（liàng）技术进行（háng）系统整合，并在反（fǎn）应（yīng）体系中加入特定化学组分，以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸（xiōng）腺嘧啶（T）的错（cuò）配，增加PCR扩（kuò）增的特异性，从而有效控制SMN2基因非特异（yì）性扩增对检测结（jié）果的影响，准确检出高（gāo）拷贝数（shù）SMN2样本中SMN1基因第（dì）7和第8外显（xiǎn）子的（de）缺失情况（kuàng）。

　　鉴于国（guó）内外尚（shàng）无（wú）任何（hé）按照体外诊（zhěn）断试剂（jì）批准上（shàng）市的SMA分子（zǐ）诊（zhěn）断产品，因（yīn）此（cǐ）临床试验方案中（zhōng）依据EMQN关于（yú）《SMA分子诊断最佳实践（jiàn）指南》，采（cǎi）用了国内外SMA体外（wài）辅助分子诊断（duàn）领域公认的PCR-RFLP法作为对照方法（fǎ）。临床（chuáng）试验共完成1069例（lì），其中正常对（duì）照组777例，SMA病例组（zǔ）292例，统计分析结果显（xiǎn）示申（shēn）报（bào）产品与对比方法检测结果的一致性为100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正（zhèng）常成（chéng）年人大样本中目标（biāo）外显（xiǎn）子△△Ct分（fèn）布（bù）范围的调查亦显示，该产品（pǐn）的纯合突变判断界值设置合理。

　　该试剂目（mù）前批准的预期用途仅包（bāo）含纯合缺失（shī）的（de）检测，尚不能用于（yú）杂合（hé）缺失（shī）的检测，因此无法用（yòng）于SMA携带者的筛查，这是（shì）该产品的（de）缺陷（xiàn）之一。

　　事（shì）实（shí）上（shàng），该产品在设计上已考虑到SMA携带者的（de）检测，其检测原理是以待测样本中目标外（wài）显子荧光信号Ct值与（yǔ）内参基因荧光信号Ct值之差（△Ct_s），与正常对照品三个（gè）梯（tī）度稀释（shì）品中目标（biāo）外显（xiǎn）子荧（yíng）光信号（hào）Ct值和内参基因荧光信号Ct值之差的平均值（△Ct_a）之（zhī）差，即△△Ct，作为（wéi）待（dài）测（cè）样（yàng）本中目标外（wài）显（xiǎn）子（zǐ）拷贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据（jù）实时荧光定量PCR相对定量（liàng）的基（jī）本数学原理推导得到申报产品检（jiǎn）测变量△△Ct的计算公（gōng）式，依据这（zhè）一计（jì）算公式可推导出纯合缺（quē）失、杂合缺失和野生型的△△Ct理论（lùn）值（或范围（wéi））；再结合目（mù）标外显子（zǐ）与内参基因（yīn）扩增效率差异以及SMN2不同（tóng）拷贝数的影响，可对上述（shù）△△Ct理论值进行优（yōu）化。结果显示纯合（hé）缺失（shī）、杂合缺失和野生型的△△Ct值（或范围）之间可（kě）设置合理的判（pàn）断界值（zhí），因此理论上该（gāi）产品（pǐn）可分别（bié）检（jiǎn）测（cè）出三种基（jī）因状态。但鉴于生（shēng）产企业（yè）对杂合缺（quē）失与野生型之（zhī）间的判断界（jiè）值研究尚不透彻（chè），再加上缺（quē）乏可判定杂合（hé）缺（quē）失的对比方法（fǎ）等其他困难（nán），本次注册申请的预（yù）期用途仅限（xiàn）于检测纯（chún）合突（tū）变，即SMA患者辅助诊断。

　　综（zōng）上，SMN1基（jī）因外显（xiǎn）子缺失检测（cè）在（zài）SMA疾病诊断和SMA携带者筛查（chá）中具有重要的临床价值。然而到目前为止，受到技术（shù）水平的（de）限（xiàn）制，相关的体外诊断（duàn）试（shì）剂比较缺乏，特别是可用（yòng）于SMA携带者筛查的杂合缺失检测，尚无适合的体外（wài）诊断试剂上市（shì）。（器审中心审评六部  何（hé）静云）

来源（yuán）：中国医药报